舞台は、世界中に夢と希望を与えてきたディズニーの礎ともいうべき、カリフォルニアにあるウォルト・ディズニー・アニメーション・スタジオ。スタッフたちが帰宅し、アニメーション・スタジオ内に誰もいなくなると、ミッキーマウスが「もう平気？誰もいない？」とティンカー・ベルに確認する。ミッキーマウスがミニーマウスと共に「写真の時間だよ！」と他のキャラクターたちに呼びかけると、壁に飾ってある絵の中からお馴染みのキャラクターたちが続々と登場。果たして写真撮影は無事成功するのか...!?

『ワンス・アポン・ア・スタジオ-100年分の思い出-』は、時代を超えて世界中の人々に愛され続けるウォルト・ディズニー・カンパニーの創立100周年を記念した短編アニメーション映画。全てのディズニーキャラクターたちが集い、“100年目の記念撮影”を行う様子を描いている。